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猫头鹰的食性因种类和体型差异显著，但总体以小型动物为主。大型猫头鹰（如雕鸮、雪鸮）主要捕食田鼠、老鼠、兔子甚至小型鸟类，部分种类如渔鸮会捕鱼。中型猫头鹰（如长耳鸮）则以昆虫、两栖动物和小型爬行动物为食，而小型猫头鹰（如红角鸮）多以昆虫为主。
它们的捕食策略高度依赖夜间视觉和听觉：大而前突的眼睛提供立体视觉，能精准定位3米外移动仅5毫米的猎物；不对称的耳孔则帮助通过声音定位。进食时，猫头鹰会将猎物整只吞下，消化后吐出无法吸收的骨骼和毛发形成的“食丸”。这种高效的捕食机制使其成为生态系统中重要的捕食者。
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